栉孔扇贝异精雌核发育四倍体早期胚胎发育的细胞学荧光显微观察

用1500μW/cm2的紫外线照射长牡蛎(Crassostrea gigas)精子60 s以进行灭活处理,并使之与栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵子受精,在卵子受精后排出第一极体前用6-DMAP(50 mg/L)处理受精卵,持续处理35 min,抑制第一极体和第二极体的排放,诱导异精雌核发育四倍体。采用二脒基苯基吲哚(DAPI)荧光染色显微观察法,对灭活的长牡蛎精子诱导的栉孔扇贝雌核发育四倍体早期胚胎发育过程进行细胞学观察。结果表明:经紫外线灭活过的长牡蛎精子进入栉孔扇贝卵子后发生轻微膨胀;在第一次卵裂中期,精核形成一致密的染色质小体(DCB),位于两组分开的母本染色体之间,不参与核分裂;第一次卵裂结束时DCB滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其中一分裂球中;第二次卵裂过程中,DCB的去向与第一次卵裂时基本一致。6-DMAP处理有效地抑制了第一极体和第二极体的排出,从而使雌核四倍化。对担轮幼虫染色体倍性分析结果表明,通过本方法可以获得6.25%的四倍体幼虫。本研究还对灭活的异源长牡蛎精子诱导栉孔扇贝雌核发育四倍体过程中产生的复杂倍性、核物质分离紊乱及多精附卵现象进行了观察和分析。     

黄渤海区三重刺网渔业结构分析

为确定三重刺网适用范围,促进《全国海洋捕捞渔具目录》的实施,于2015年在黄渤海区以三重刺网渔业为研究对象,调查了刺网渔船渔业动态和三重刺网渔具种类和作业参数,并追踪调查了代表性渔具的渔获结构、产量和产值,对三重刺网作业渔船的捕捞能力与经济效益加以分析。结果表明,三重刺网渔具对甲壳类和鲆鲽类的选择性较强,捕捞效果好,兼捕幼鱼比例相对较低,是目前近海捕捞渔具中选择性比拖网和张网相对较好的作业渔具。但鉴于目前生产中使用的三重刺网内网衣网线较细,缠绕力强,兼捕现象较为严重,在经济鱼类幼鱼较多的渔场作业,会对渔业资源造成较大的损害。同时从渔民收入角度出发,三重刺网过渡期以后的归属管理应开展进一步调查和研究。     

桑沟湾不同养殖区大型底栖动物的群落结构特征

于2016年9月和11月对我国北方典型筏式养殖海湾—桑沟湾的筏式贝藻养殖区和网箱养殖区的大型底栖动物进行调查,研究了桑沟湾不同养殖区大型底栖动物的种类组成、数量分布、群落结构及生物多样性等群落特征,分析了底栖动物与海洋环境因子的关系,以了解养殖活动对大型底栖动物的影响。结果显示,调查共鉴定出大型底栖动物67种,其中,环节动物多毛类36种,软体动物12种,节肢动物门甲壳类和全足类16种,棘皮动物3种。桑沟湾大型底栖动物的优势种主要为多毛类,贝藻区的绝对优势种为刚鳃虫和长叶索沙蚕,网箱区的绝对优势种为异足索沙蚕和多丝独毛虫。生物量和丰度的特性为9月网箱区11月网箱区9月贝藻区,多样性指数的趋势相反。研究表明,底栖动物群落特征与底质有机碳、总磷、硫化物和氧化还原电位等因素有关,桑沟湾大规模养殖活动对底栖动物群落组成和分布产生了一定的影响。     

海蜇Frizzled1基因的克隆及在无性繁殖中的表达

采用RACE技术解析了海蜇(Rhopilema esculentum)Frizzled1基因的cDNA和基因组结构:Re-Fzd1基因的全长cDNA为2387 bp,其中编码区为1761bp,编码586个氨基酸的多肽。SMART分析表明,Re-Fzd1基因具备Fzd家族共同的结构特征,包括:一个由23个氨基酸组成的信号肽,一个位于N-末端富含10个保守半胱氨酸残基的半胱氨酸富集域(CRD),一个含有7个跨膜片段的跨膜结构域,以及一个含有5个重要的磷酸化位点的C端尾巴。多序列比对表明,Re-Fzd1基因与刺胞动物贝螅(Hydra echinata)、水螅(Hydra vulgaris)、半球美螅水母(Clytia hemisphaerica)和海葵(Nematostella vectensis)Fzd1具有高度相似性,与来自脊椎动物人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、爪蟾(Xenopus laevis)和斑马鱼(Danio rerio)的Fzd1、Fzd2和Fzd7家族基因也具有较高的同源性。基于N-J法,将人、鼠、爪蟾、斑马鱼和果蝇(Drosophila melanogaster)所有Fzd家族基因系统进化分析显示,除果蝇外,所有Fzd家族成员聚类成4个类群,11个亚家族,海蜇Re-Fzd1基因首先与刺胞动物门的Fzd1聚类在一起,然后与脊椎动物Fzd1、Fzd2和Fzd7三个家族聚成一个类群,表明脊椎动物Fzd1、Fzd2和Fzd7家族可能与刺胞动物门的Fzd1起源于同一个共同祖先。Re-Fzd1基因组序列中不含有内含子。实时荧光定量PCR结果显示,Re-Fzd1基因在海蜇无性繁殖的4个发育阶段均有表达,其中,表达量最高的横裂体阶段是表达量最低的稚水母阶段的3.67倍。整体原位杂交显示,在海蜇横裂体时期,Re-Fzd1原位表达在触手、基座及发生横裂的部位。这些结果都表明,Re-Fzd1不但参与了海蜇的早期发育过程,还调控了海蜇无性繁殖的发生。     

基于牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因的巢式PCR检测方法的建立及应用

为了建立适用于Os HV-1不同变异株的检测方法,在牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)3个变异株全基因组序列比对的基础上,筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的DNA聚合酶(DNA polymerase)基因,据此设计巢式PCR引物,优化PCR反应体系和条件,建立了基于Os HV-1 DNA聚合酶基因的巢氏PCR检测方法(P-n PCR检测方法),利用P-n PCR与Cn PCR检测方法对不同年份和宿主来源的Os HV-1疑似感染样本进行检测。结果显示,Pn PCR检测方法能稳定地检出100拷贝/μL的病毒DNA;P-n PCR较C-n PCR检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明,本研究建立的P-n PCR检测方法适用于Os HV-1不同变异株的检测,可为该病毒的检测和流行病学调查提供可靠的技术支持。     

魁蚶过氧化氢酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆出魁蚶过氧化氢酶(Sb CAT)基因c DNA全长序列,该基因全长为2181 bp,包括1431 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),96 bp的5'端非翻译区(UTR)和654 bp的3'-UTR。其中ORF编码477个氨基酸,预测分子量为54 ku,理论等电点为8.03。Sb CAT氨基酸序列与其他所选动物的氨基酸序列具有较高的相似性,其相似度为68%~96%,Sb CAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位点,1个亚铁血红素结合位点及3个催化位点残基。此外,Sb CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合位点。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测了Sb CAT的组织表达特征。结果显示,Sb CAT m RNA在所检测的6种组织中均有表达,在外套膜中表达量较高,在肝胰腺和红细胞中表达量较低。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,鳗弧菌刺激组的外套膜表达量一直较低,其他组织均表现出先上升再下降的趋势。研究表明,Sb CAT可能在魁蚶免疫防御中发挥重要作用。     

牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立牡蛎疱疹病毒魁蚶株快速、灵敏、准确和操作简便的检测方法,实验根据已测序完成的OsHV-1-SB全基因组序列,选择其保守区域,建立了交叉引物等温扩增检测方法,并对反应温度、dNTPs、Mg2+浓度和反应时间进行了优化.结果显示,最佳温度为63℃,反应时间为60 min,dNTPs浓度为1.4 mmol/L,Mg2+浓度为6 mmol/L.该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA,并且特异性较强,与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应.使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、辽宁大连共计22份OsHV-1-SB感染情况未知的魁蚶样品进行了检测.研究表明,实验所建立的OsHV-1-SB的CPA检测方法简单、快速、灵敏且特异性强.由于其检测结果可通过简单离心或者向反应管中加入核酸荧光染料GeneFinderTM进行肉眼观察,所以可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用,具有较好的应用前景.     

中国明对虾MKK4基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达分析

为初步研究中国明对虾MKK4的生物学功能,采用RACE技术克隆获得中国明对虾MKK4基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾MKK4基因全长为2 064 bp,开放阅读框长1 221 bp,5'非编码区长214 bp,3'非翻译区长629 bp。将该基因命名为FcMKK4。推测该基因编码406个氨基酸,预测分子量为45.94 ku,理论等电点为8.50。同源性和系统进化分析发现FcMKK4与肩突硬蜱和印度跳蚁的同源性分别为80%和78%,与其他节肢动物MKK4聚为一支。荧光定量RT-PCR结果表明,FcMKK4基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为肝胰腺。氨氮胁迫后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的表达量均显著增加,并有不同的时空表达谱式,表明FcMKK4可能参与中国明对虾非生物胁迫的应答反应。     

一株引起坛紫菜绿斑病病原的分离鉴定及致病性研究

为了明确引起坛紫菜绿斑病的病原,对2012年发生在福建省莆田养殖海区坛紫菜叶状体绿斑病开展了病原的分离鉴定和致病性研究。利用2216E海水培养基平板,从患病藻体分离得到一株优势细菌X5;在实验室条件下将X5进行回接感染实验,在显微镜下观察到坛紫菜叶状体发生组织病理变化,出现绿斑病症状:感染初期出现黄绿色小斑点,病斑逐渐扩大出现空洞,最后导致紫菜叶片流失;用浓度为10⁴~10⁸ cfu/mL的X5感染坛紫菜时,在7 d内引起紫菜出现10%~100%病斑面积,这些结果表明X5为坛紫菜绿斑病的病原。利用生理生化和多基因序列分析方法对X5进行鉴定,结果显示该菌为革兰氏阴性菌,大小为0.6 μm×0.4 μm~1.0 μm×0.4 μm,无鞭毛,在温度4~42℃、盐度50~150、pH6~10范围内生长,最适生长温度为16℃,最适生长盐度为50,最适pH为7,对甲硝唑、林可霉素和青霉素耐药,对25种抗生素敏感,Biolog和API ID-32E细菌鉴定系统的结果显示X5为弧菌属细菌(Vibriosp.);基于多基因序列(16S rRNA,rpoA,recA,pyrH)构建的系统进化树分析显示,X5与V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis聚为一支,进化距离为0.095~0.108,这些结果说明X5为弧菌属的一个新种或是V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis之一的一个新亚种。本研究报道了弧菌X5能够引起坛紫菜绿斑病,为紫菜流行病学及疾病防治提供了理论支撑。     

桑沟湾水域叶绿素a在海带收获前后的变化及其影响因素

依据2014年5月和8月2个航次走航和定点连续调查资料,分析了桑沟湾水域叶绿素a的空间分布及海带养殖区叶绿素a(Chl.a)的昼夜变化特征,同时结合所调查的温度、盐度 、pH和营养盐等分布特征,分析了桑沟湾水域Chl.a浓度与理化因子的关系,探讨了海带收获前后Chl.a的变化及其影响因素。(1)走航调查的结果显示,桑沟湾夏季Chl.a浓度显著高于春季。桑沟湾春季表、底层总Chl.a浓度均值分别为(0.67±0.39)和(0.50±0.31)μg/L,表层Chl.a浓度高于底层,春季表层整体表现出自湾内向湾外逐渐降低的趋势;夏季表、底层总Chl.a浓度均值分别为(3.39±1.53)和(3.12±1.43)μg/L,表层Chl.a浓度高于底层。桑沟湾夏季表层Chl.a高值区出现在海带养殖区,低值区出现在贝类养殖区,夏季底层Chl.a高值区出现在贝类和海带养殖区,低值区出现在外海区。(2)定点连续监测结果显示,春季海带养殖区Chl.a浓度变化范围在0.24~0.95 μg/L,均值为(0.70±0.19)μg/L,昼夜波动较小。而夏季海带养殖区Chl.a浓度变化范围在2.01~4.66 μg/L,均值为(3.04±0.82)μg/L,昼夜波动较大。桑沟湾海带养殖区夏季Chl.a浓度显著高于春季。春季海带养殖区营养盐平均浓度及硅磷比、氮磷、硅氮比均显著低于夏季。(3)桑沟湾春季表层Chl.a浓度主要与温度、硅酸盐呈显著正相关,而夏季底层Chl.a浓度与盐度呈显著正相关。桑沟湾海带收获前后Chl.a的变化及分布受温度、硅酸盐、盐度、养殖环境状况和水文环境的共同影响,多元的贝藻养殖模式是影响Chl.a变化及分布的重要因素。